神經(jīng)元分化，是指祖細胞通過(guò)有絲分裂產(chǎn)生神經(jīng)元的過(guò)程，該過(guò)程由一系列轉錄因子（TFs）調節。這些TFs調節神經(jīng)元末端效應基因的表達，這些基因可以調控神經(jīng)元功能，例如神經(jīng)遞質(zhì)、離子通道以及附加TFs。TFs必須駕馭復雜的染色質(zhì)圖譜，才能結合適當的增強子促進(jìn)或抑制基因表達。但多數情況下，在神經(jīng)元分化和成熟過(guò)程中，TFs表達下調，末端效應基因的表達卻能保持穩定。那么關(guān)鍵TFs的短暫表達是如何維持基因轉錄？由于目前無(wú)法大規模地準確量化TFs基因組間的相互作用，這方面的研究進(jìn)展緩慢。

2016年12月21日，Rhee教授及其同事在《神經(jīng)元》雜志中發(fā)表了一篇論文，文章表明通過(guò)分析染色質(zhì)可及性，并利用TFs結合位點(diǎn)的高分辨率映射可將胚胎干細胞（ESCs）逐步分化為下運動(dòng)神經(jīng)元。研究人員在一個(gè)可控制的體外系統再現了發(fā)育過(guò)程中TFs的動(dòng)態(tài)表達，其中Isl1和Lhx3是成熟神經(jīng)元效應基因轉錄所必需的轉錄因子，但Lhx3表達水平下調，并不改變末端效應基因的表達水平。ESCs在TFs的作用下先分化為表達 Isl1 和 Lhx3 的新生運動(dòng)神經(jīng)元，然后成熟為保留 Isl1 表達但Lhx3 表達水平下調的下運動(dòng)神經(jīng)元。 

Rhee教授等研究人員采用染色質(zhì)開(kāi)放性測序技術(shù)（ATAC-seq）、通過(guò)轉座子插入探測基因組的納米探針技術(shù)以及組蛋白H3K27的染色質(zhì)免疫沉淀測序技術(shù)（ChIP-seq）檢測ESCs分化過(guò)程中染色質(zhì)的可及性。他們觀(guān)察到，基因表達的變化相對較小, 但在新生和成熟的下運動(dòng)神經(jīng)元分化過(guò)程之間存在非?；钴S的活性增強子。

那么這些只有一小段可訪(fǎng)問(wèn)性的增強子的作用是什么？研究發(fā)現，Isl1和Lhx3以一種十分少見(jiàn)的方式來(lái)確保運動(dòng)神經(jīng)元分化期間基因穩定表達。在新生的運動(dòng)神經(jīng)元中，Isl1首先與Lhx3形成臨時(shí)異源二聚體，與末端神經(jīng)元效應基因非?？拷乃矔r(shí)增強子結合。隨后，由于Lhx3在神經(jīng)元成熟期間被下調，Isl1被釋放與相同神經(jīng)元效應基因中新位點(diǎn)的Onecut1相結合（圖1A）。Isl1分別與早期和成熟增強子結合的這種中繼作用，確保效應基因持續表達，該產(chǎn)物對成熟神經(jīng)元功能至關(guān)重要。相比之下，Ngn2在分化開(kāi)始時(shí)短暫表達，通用神經(jīng)元識別必要的、與Isl1異源二聚體共享很少的位點(diǎn)進(jìn)行結合，這表明它獨立工作激活另一組神經(jīng)元分化所需的基因。

在接下來(lái)的實(shí)驗中，Rhee 等人研究了早期和成熟增強子在人體內是否具有時(shí)間特異性。研究人員準備了一組人工增強子，在胚胎雞脊髓運動(dòng)神經(jīng)元分化過(guò)程中控制GFP的表達。實(shí)驗結果表明，早期增強子在電穿孔后 24 小時(shí)內促進(jìn)產(chǎn)生 GFP，但無(wú)法在 48 小時(shí)內維持 GFP的表達，而成熟增強子直到電穿孔后 48 小時(shí)才促進(jìn)GFP表達水平上調。在與內源性神經(jīng)元基因類(lèi)似的結構中，與早期和成熟增強子結合的報告基因在運動(dòng)神經(jīng)元分化過(guò)程中持續促進(jìn)GFP的表達。使用 CRISPR/Cas9 引導去除與 Isl1 和運動(dòng)神經(jīng)元基因 Hb9 相關(guān)的早期和成熟增強子，在ESCs的運動(dòng)神經(jīng)元分化中進(jìn)一步驗證了這一階段增強子的時(shí)間特異性。

Isl1 從早期增強子到成熟增強子的逐步轉移是如何發(fā)生的呢？Rhee教授稱(chēng)Isl1 轉移是通過(guò)競爭性結合發(fā)生的，其中 Lhx3 與 Onecut1 競爭與Isl1 結合，Isl1轉移到 Onecut1 可能是由于 Lhx3 在神經(jīng)元成熟時(shí)表達水平下調。有趣的是，Isl1主要與Lhx3 或 Onecut1相互作用，在此之前Lhx3和Onecut1已經(jīng)與它們的增強子結合，與Isl1結合之后激活相關(guān)基因。這項成果表明基因可以通過(guò) Onecut1 和 Lhx3 等因子啟動(dòng)表達，隨后通過(guò)Isl1的競爭性轉移，激活并穩定表達。這為基因轉錄狀態(tài)增加了另一個(gè)維度，同源“錨點(diǎn)”（例如 Lhx3 或 Onecut1）可誘導結合與基因轉錄相關(guān)的轉錄因子，激活并穩定基因表達。

(A) 在誘導神經(jīng)元分化過(guò)程中，外源性應用維甲酸 (RA)、平滑激動(dòng)劑 (SAG) 和 g-分泌酶抑制劑 (DAPT) 促進(jìn)胚胎干細胞 (ESCs) 在 6 天內分化為下運動(dòng)神經(jīng)元。在分化過(guò)程中，神經(jīng)元效應器的表達由作用于早期瞬時(shí)增強子的 Isl1/Lhx3 異二聚體激活表達，然后下調 Lhx3 并將 Isl1 轉移到 Onecut1 結合成熟的增強子上維持表達。

(B)神經(jīng)元分化通過(guò)編程強制表達轉錄因子,在 48 小時(shí)內將 ESCs分化為新生運動(dòng)神經(jīng)元—— Lhx3、Isl1 和 Ngn2.Lhx3/Isl1 與早期增強子結合抑制增殖基因的表達，隨后轉移到成熟增強子與 Onecut 和 Ebf 轉錄因子結合促進(jìn)神經(jīng)元效應基因表達。

新生的運動(dòng)神經(jīng)元也可以通過(guò)直接編程ESCs分化得到，該方法通過(guò)強制表達 Isl1 和 Lhx3 以及 Ngn2，使神經(jīng)元效應基因在 48 小時(shí)內持續表達。

與 ESCs的逐步分化相比，同一類(lèi)TFs如何在染色質(zhì)可及性和可用輔助因子不一致的情況下誘導效應基因轉錄？Velasco教授及其同事分析了 Ngn2、Lhx3 與Isl1 結合過(guò)程中動(dòng)力學(xué)原理及其在運動(dòng)神經(jīng)元分化中開(kāi)始 48 小時(shí)內對轉錄組和染色質(zhì)行為的影響。值得注意的是，增強子的整體作用邏輯也適用于直接編程運動(dòng)神經(jīng)元，但稍有不同。Velasco 教授使用 ChIP-seq技術(shù)發(fā)現大量與Lhx3/Isl1 異二聚體結合的早期增強子，這些增強子與祖基因相關(guān)，而不是與神經(jīng)元效應基因相關(guān)。此外，隨著(zhù)早期增強子與Lhx3/Isl1之間相互作用促進(jìn)基因表達的能力慢慢減弱，染色質(zhì)狀態(tài)受限制程度越來(lái)越高。隨后，Lhx3/Isl1與神經(jīng)元功能相關(guān)的末端效應基因上的成熟增強子相結合，這些成熟增強子與Lhx3/Isl1之間相互作用促進(jìn)基因表達。該系統中轉錄因子在兩步過(guò)程中抑制祖細胞特征并促進(jìn)神經(jīng)元分化。

Velasco教授等研究人員表明，在定向分化的條件下，Isl1 在晚期增強子處與 Lhx3 和 Onecut 相互作用（圖 1B），這些對比觀(guān)察結果與 Rhee 等人提出的競爭性結合模型情況不符?？赡苁怯捎谥苯臃只^(guò)程中Isl1/Lhx3突然和持續的表達，或者是它缺乏外源性 RA-Shh 和 Notch 抑制誘導的分化程序，Isl1/Lhx3 可以訪(fǎng)問(wèn)在ESCs誘導分化過(guò)程中不采用的結合位點(diǎn)。此外，如果Isl1表達過(guò)量并保持 Lhx3表達水平，則 Isl1 與 Onecut1 或 Lhx3 的競爭性結合可能無(wú)關(guān)緊要，Isl1 和 Lhx3可同時(shí)與成熟的增強子結合。直接分化過(guò)程中TFs的受控表達確實(shí)為研究人員提供了了解每個(gè)TFs獨立作用的機會(huì )。

通過(guò)敲除 Lhx3 和 Isl1，Velasco 等研究人員揭示 Ngn2促進(jìn)了One-cut和EbfTFs 的后續表達。此外，如果 Lhx3/Isl1在沒(méi)有Ngn2 的情況下表達，它們向晚期增強子轉移的能力會(huì )嚴重降低。這闡明了 Ngn2 和 Isl1/Lhx3 分別與兩組互斥增強子初始結合后，如何最終匯聚在成熟增強子上，從而形成基因調控的前饋控制系統。這兩項研究都說(shuō)明了增強子在細胞進(jìn)行有絲分裂形成神經(jīng)元過(guò)程中的重要性。

利用前饋TFs系統按次序分程調節基因表達是否具有生物學(xué)價(jià)值？在分化過(guò)程中，運動(dòng)神經(jīng)元亞型分化需要維持一般神經(jīng)元基因表達和激活細化神經(jīng)元亞型的特定基因表達，如離子通道表達以控制尖峰頻率。早期增強子的短暫結合可能會(huì )觸發(fā)一系列TFs，每個(gè)TFs都與瞬時(shí)增強子結合以產(chǎn)生下一組繼續細化基因表達的TFs。隨著(zhù)這種前饋過(guò)程的進(jìn)行，中繼增強子可以穩定神經(jīng)元亞型之間的基因表達。在成熟神經(jīng)元中持續使用瞬時(shí)增強子將極大地加快細胞重編程和細胞替代療法的研究進(jìn)程。由于這些神經(jīng)元模型在臨床和研究環(huán)境中的效用，研究人體內環(huán)境與運動(dòng)神經(jīng)元逐步或直接分化后最終狀態(tài)之間的聯(lián)系則至關(guān)重要。這些研究為有絲分裂后基因的表達和細胞分化過(guò)程中染色質(zhì)景觀(guān)的重組所必需的機制提供了相對可靠的結論，也為繼續深入研究提供了可能性。

寧波易賽騰生物科技有限公司    李福云編譯

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Transcription Factor Hand-offs “Enhance” Motor Neuron Differentiation - ScienceDirect