5月5日，哈佛大學(xué)布羅德研究所和麻省劍橋麻省理工學(xué)院的Evan Macosko教授領(lǐng)導的研究團隊在《自然神經(jīng)科學(xué)》上發(fā)表了一項研究報告，文章表明，研究人員使用轉錄組分析確定了人類(lèi)黑質(zhì)致密部中10種轉錄不同的多巴胺能（DA）神經(jīng)元群；其中一種以SOX6和AGTR的表達為標志，在PD和路易體癡呆(DLB)患者中選擇性地退行性變；這些細胞位于黑質(zhì)的腹側部分，比其他任何多巴胺能神經(jīng)元亞型表達更多PD風(fēng)險基因，這表明這些突觸核蛋白病中的神經(jīng)變性是一個(gè)細胞內在過(guò)程，而不是由其他細胞造成的。

在帕金森病的研究進(jìn)程中，DA神經(jīng)元選擇性脆弱的分子機制研究一直進(jìn)展緩慢。研究人員通過(guò)單細胞 RNA 測序技術(shù)確定了區分堅韌和脆弱神經(jīng)元的基因表達譜。然而，由于黑質(zhì)致密部的體積很小，內部和周?chē)嬖诖罅考毎?，梳?DA 神經(jīng)元以及它們的不同亞群就成為一項十分棘手的工作。此外，之前的單細胞轉錄研究很難檢測到不同的細胞亞群，因此也無(wú)法在樣本之間進(jìn)行可靠的比較。

為了從死后的大腦樣本中獲取更多的細胞核，Tushar Kamath和Abdulraouf Abdulraouf教授及其同事首先確定獨特的核標記物 （Nr4a2），這是一種只有 DA 神經(jīng)元表達的轉錄因子。然后他們從8名沒(méi)有神經(jīng)退行性疾病的死者黑質(zhì)樣本中分離出細胞核。通過(guò)Nr4a2分選，研究人員獲得了5684個(gè)DA神經(jīng)元核并用于RNA測序分析，該數量是之前研究樣本數量的180倍。

研究人員從死后的大腦中提取出黑質(zhì)致密部，分離出細胞核，并使用 NR4A2 蛋白分選出來(lái)自DA神經(jīng)元的細胞核，以進(jìn)行轉錄組分析。[Courtesy of Kamath et al., Nature Neuroscience, 2022.]

通過(guò)比較多個(gè)樣本轉錄本，Kamath教授從DA神經(jīng)元群中提取了10個(gè)不同的轉錄組亞群。這些亞群在DA神經(jīng)元標志物SOX6和CALB1的表達上存在明顯差異，其中四個(gè)亞群優(yōu)先表達 SOX6，而另外六個(gè)傾向于表達CALB1。

研究人員在獼猴黑質(zhì)中發(fā)現了10個(gè)相似的DA神經(jīng)元轉錄組亞群。有趣的是，在小鼠和大鼠中，他們檢測了所有亞群，只有一個(gè)亞群以CALB1和GEM的表達為標志，這表明標志物SOX6和CALB1的表達只發(fā)生在靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物中。研究人員正在進(jìn)一步分析這個(gè)亞群，他們預測它可能位于黑質(zhì)環(huán)路的后面，靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物中已經(jīng)存在這種環(huán)路，但嚙齒動(dòng)物目前并沒(méi)有檢查到。Macosko教的團隊正在研究這個(gè)回路的作用是什么，以及它是否與神經(jīng)退行性疾病有關(guān)。

這些不同類(lèi)型的DA神經(jīng)元在黑質(zhì)中的確切位置到底在哪？為了解決這個(gè)問(wèn)題，研究人員將Slide-Seq技術(shù)應用于獼猴黑質(zhì)，在獼猴SNpc中定位這10個(gè)DA神經(jīng)元亞群。值得注意的是，其中一個(gè)以 SOX6 和 AGTR1 表達為標志的亞群完全位于黑質(zhì)的腹側部分，這是一個(gè)已知在 PD 中變性的區域。

來(lái)自獼猴黑質(zhì)致密部（左）的區域（圓圈）的 RNA 被轉移到DNA條碼的珠子陣列中進(jìn)行空間轉錄。 SNpc 的腹側和背側都包含 DA 神經(jīng)元（頂部，黑色），但其亞型在 SNpc（中間和底部面板）上的分布不同。淺藍色的最容易在 PD中死亡。[Courtesy of Kamath et al., Nature Neuroscience, 2022.]

為了確定這些亞群中的哪些神經(jīng)元最容易在神經(jīng)退行性疾病中死亡，研究人員對10名死于PD或DLB患者的黑質(zhì)樣本進(jìn)行了snRNA-Seq檢測。結果顯示，與健康供體相比，PD或DLB患者DA神經(jīng)元稀少。AGTR1亞群消耗的最多，這表明這種類(lèi)型的DA神經(jīng)元特別容易受到神經(jīng)變性的影響。相比之下，另外兩個(gè)表達CALB1的DA神經(jīng)元亞群在 PD/DLB 患者中保留較多。

其次，表達GPNMB的小膠質(zhì)細胞亞群被擴大，星形膠質(zhì)細胞亞群也是如此。這些發(fā)現反映了 PD 和 DLB 中重疊的神經(jīng)退行性機制，它們都是突觸核蛋白病，但也有差異。斯德哥爾摩卡羅林斯卡研究所的Ernest Arenas教授在論文隨附的評論中指出，DLB 患者除了DA神經(jīng)元損失及其伴隨的運動(dòng)障礙癥狀外，還存在認知下降、Aβ斑塊和tau纏結。在這種情況下，該分析僅提供了這兩種疾病常見(jiàn)變化的信息，疾病特異性變化并沒(méi)有反映出來(lái)，未來(lái)則需要對更多的PD或DLB患者樣本分析，以進(jìn)行深入研究。

為了了解DA神經(jīng)元的AGTR1亞群為何如此容易受到PD或DLB影響，研究人員檢測了黑質(zhì)所有細胞類(lèi)型的轉錄組，以尋找與 PD風(fēng)險相關(guān)的基因的表達。其中包括26個(gè)已被確定為罕見(jiàn)的家族性PD變異的基因，以及無(wú)數個(gè)與PD風(fēng)險相關(guān)的常見(jiàn)變異基因。

作為一個(gè)整體，DA神經(jīng)元表達的這些PD風(fēng)險基因比其他細胞類(lèi)型都多。在DA神經(jīng)元中，PD遺傳風(fēng)險基因最 大且具有統計學(xué)意義的是AGTR1亞型。

不同細胞類(lèi)型的轉錄亞群表達了與PD相關(guān)的不同水平的基因。 在10個(gè)DA神經(jīng)元亞群中，只有AGTR1+亞群的PD風(fēng)險顯著(zhù)增加（上圖）。 不同的PD風(fēng)險基因在SOX6+AGTR1+細胞（紅色）、SOX6+ 細胞（橙色）以及更廣泛的DA神經(jīng)元（黃色）中增加。 [Courtesy of Kamath et al., 2022.]

在A(yíng)GTR1+DA神經(jīng)元亞群中，哪些細胞通路可能在PD中決定它們的命運？這一點(diǎn)目前尚不清楚，但研究人員發(fā)現，在這種易受影響的亞型中，與細胞應激和線(xiàn)粒體功能障礙有關(guān)的基因表達有所增加；AGTR1本身編碼血管緊張素受體1，并發(fā)揮作用；在日本人群中，該基因的變異與PD風(fēng)險有關(guān)，已知的腎素-血管緊張素系統的抑制劑可增強 PD 患者的運動(dòng)功能。

與DA神經(jīng)元相比，神經(jīng)膠質(zhì)細胞沒(méi)有表達過(guò)多的PD風(fēng)險基因。這些細胞傾向于表達與AD相關(guān)的風(fēng)險基因。這些發(fā)現表明PD患者中神經(jīng)退行性變主要是細胞的內在過(guò)程，而在 AD患者中，神經(jīng)元死亡更多地與包括小膠質(zhì)細胞在內的其他細胞類(lèi)型之間的相互作用相關(guān)。

波士頓哈佛醫學(xué)院的 Ole Isacson 持不同觀(guān)點(diǎn)。他認為，大多數PD是散發(fā)性的，這意味著(zhù)它是由脆弱的DA神經(jīng)元與外部壓力源相互作用引起的。他解釋說(shuō)細胞中線(xiàn)粒體和細胞應激通路在這個(gè)脆弱的亞群中被激活，細胞處于高壓之下。平均而言，SNpc DA神經(jīng)元的氧化應激水平是附近區域神經(jīng)元的四倍，這種壓力的影響會(huì )累積，使細胞更容易受到外部損傷，例如環(huán)境毒素和神經(jīng)炎癥。Isacson教授稱(chēng)，SNpc中對脂質(zhì)應激持續炎癥反應的標志是表達 GPNMB 的小膠質(zhì)細胞的比例增加。他的數據與表明TNF-α抑制劑可降低 PD 風(fēng)險的研究結果相結合，表明脆弱的DA神經(jīng)元的內在壓力和不斷增加的神經(jīng)炎癥損傷的共同作用可能會(huì )隨著(zhù)年齡的增長(cháng)而達到神經(jīng)退行性“沸點(diǎn)”。

馬里蘭州貝塞斯達國立衛生研究院的Mark Cookson教授同意PD風(fēng)險基因分析需要更進(jìn)一步的研究，并指出分析中考慮的幾個(gè)基因與 PD有不確定的關(guān)系。

波士頓布萊根婦女醫院的Clemens Scherzer教授稱(chēng)，選擇脆弱性是神經(jīng)退行性疾病的主要謎團之一，這項研究識別出部分中腦中選擇性脆弱的DA神經(jīng)元亞型，并為可能的亞型提供研究思路。

然而，Scherzer 指出，雖然該研究解決了 SNpc 內多巴胺能神經(jīng)元之間的差異問(wèn)題，但它并沒(méi)有解釋為什么SNpc DA神經(jīng)元比鄰近腹側被蓋區域的神經(jīng)元更容易受到PD的影響。 中腦中最 具抵抗力的DA神經(jīng)元，即 VTA 多巴胺神經(jīng)元，似乎并沒(méi)有被包括在內。 

Macosko表示，該實(shí)驗室目前正在研究位于大腦不同區域以及周?chē)窠?jīng)系統中的DA神經(jīng)元的轉錄組。 他希望研究人員能夠探索當前的治療目標數據集，設計更準確的疾病模型，以及區分細胞替代療法中最需要的多巴胺能神經(jīng)元類(lèi)型。

寧波易賽騰生物科技有限公司  李福云編譯

原文鏈接：

Single-Cell Sleuthing Nabs Neurons Prone to Perish in Parkinson’s | ALZFORUM