2022年1月20日，耶魯大學(xué)醫學(xué)院干細胞中心遺傳學(xué)系Bilal Cakir教授領(lǐng)導的研究團隊在《nature communication》上發(fā)表了一篇研究報告，報告表明研究人員開(kāi)發(fā)了一種從人類(lèi)胚胎干細胞 (hESCs) 誘導生成人類(lèi)皮質(zhì)類(lèi)器官 (hCOs) ，進(jìn)而產(chǎn)生功能性小膠質(zhì)細胞（即含小膠質(zhì)細胞的 hCOs ，mhCOs）的方法。在功能上，mhCOs 中的小膠質(zhì)細胞可以保護神經(jīng)元免受 Aβ 沉積引起的細胞和分子損傷；在科研上，這個(gè)方法可用于基礎研究和轉化研究，開(kāi)發(fā)研究小膠質(zhì)細胞在神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)退行性疾病中作用的體外模型。
小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統 (CNS) 中的常駐巨噬細胞。它們的主要功能是在大腦中進(jìn)行免疫監視，并通過(guò)調節神經(jīng)元存活、突觸形成、凋亡細胞消除和程序性細胞死亡來(lái)促進(jìn)大腦網(wǎng)絡(luò )的形成。研究表明，小膠質(zhì)細胞功能受損與神經(jīng)發(fā)育（即自閉癥或精神分裂癥）和神經(jīng)退行性疾?。窗柎暮Ｄ?，AD）之間存在密切聯(lián)系。因此，研究這些疾病下小膠質(zhì)細胞的功能，必須開(kāi)發(fā)對應的研究模型，模擬人腦中小膠質(zhì)細胞的功能。
3D大腦類(lèi)器官技術(shù)提供了一個(gè)研究人類(lèi)大腦如何發(fā)展和經(jīng)歷神經(jīng)系統疾病的可行性方案。通過(guò)小分子誘導或基于多功能干細胞 (PSC) 的內在神經(jīng)外胚層分化可生成腦類(lèi)器官。然而，大多數神經(jīng)外胚層分化產(chǎn)生的腦類(lèi)器官不包含中胚層細胞，例如小膠質(zhì)細胞或內皮細胞。小膠質(zhì)細胞只能從 hESC 分化或從原代組織中分離出來(lái)，與腦類(lèi)器官共培養以研究其功能?？傮w而言，以高度可重復的方式在腦類(lèi)器官中產(chǎn)生小膠質(zhì)細胞，對于了解這些細胞在人腦中的功能以及剖析它們在疾病狀態(tài)中的作用具有重要意義。
之前的研究表明，一種被稱(chēng)為 Pu.1的 ETS轉錄因子對于將細胞發(fā)育成骨髓細胞（包括小膠質(zhì)細胞）至關(guān)重要， Pu.1 的過(guò)表達可將各種細胞類(lèi)型重新編程為骨髓細胞。研究人員檢查了hCOs中 PU.1 誘導的細胞是否可以分化為功能性小膠質(zhì)細胞。共測試了兩種方案：胚狀體（EB）分化和神經(jīng)元分化（如圖1a，b）。在這兩種情況下，5 天的 PU.1 誘導明顯增加了小膠質(zhì)細胞標志物（如IBA1）和 SALL1抗體的表達。但調節小膠質(zhì)細胞存活，分化和增殖的集落刺激因子1（如Csf1r，Cd115）以及其他小膠質(zhì)細胞標志物（如Tmem119，P2ry12）的表達沒(méi)有增加（如圖1c）。小膠質(zhì)細胞標志物的有限誘導很可能是由PU.1 的短暫引入和下調相關(guān)體外環(huán)境造成的。IBA1的免疫染色結果（IF）進(jìn)一步揭示了在EB或神經(jīng)元分化的條件下過(guò)表達PU.1 5天的分化細胞中含有小膠質(zhì)細胞（如圖1d）?？傮w而言，這些數據表明，在神經(jīng)外胚層分化條件下，PU.1 過(guò)表達會(huì )誘導 hESC 分化為骨髓細胞。
研究人員進(jìn)一步測試了發(fā)育中的皮質(zhì)類(lèi)器官中 PU.1 的過(guò)表達是否可以誘導生成小膠質(zhì)細胞。由于小膠質(zhì)細胞占成熟腦細胞的 5-15%，研究員將 10% 的 PU.1 感染的 BC4 hESC 與 90% 的親本 hESC 混合以產(chǎn)生 hCOs（圖 1a）。hCOs 的 3D 實(shí)時(shí)成像揭示了 GFP+ 細胞在 30 天的 hCOs 處具有變形蟲(chóng)細胞形狀的組織（如圖 1e）。與 30 天齡的 hCOs 相比，70 天齡的 hCOs 包含更多數量的變形蟲(chóng)細胞形狀的細胞（如圖 1e）。與共聚焦成像一致，PU.1 誘導的 hCOs 在第70天表現出較多的小膠質(zhì)細胞標志物表達（如圖 1b）。此外，PU.1 誘導的 hCOs 顯示小膠質(zhì)細胞標志物 Iba1、Csf1r、Cd11b、Cx3cr1、Tmem119 和 P2ry12 的表達增加（如1b）。這些結果表明PU.1 過(guò)表達的 hCOs 含有小膠質(zhì)細胞,研究人員將這些類(lèi)器官命名為含有 hCOs (mhCOs) 的小膠質(zhì)細胞。
圖片來(lái)源于《Expression of the transcription factor PU.1 induces the generation of microglia-like cells in human cortical organoids》
為了研究在 mhCOs 中由 PU.1 誘導的小膠質(zhì)細胞是否與體內小膠質(zhì)細胞具有相似的功能，研究人員評估了30、70或90天大的mhCOs 中的小膠質(zhì)細胞特征。研究發(fā)現在第70天，22%的小膠質(zhì)細胞同時(shí)表達IBA1和MKI67，表明存在增殖的小膠質(zhì)細胞（如圖1g）；共免疫染色結果揭示了 IBA1+ 小膠質(zhì)細胞內存在 PSD95，表明功能性小膠質(zhì)細胞存在吞噬或接觸 mhCOs 中神經(jīng)元的突觸結構（如圖1h）；基于用單分子 RNA 熒光原位雜交檢測神經(jīng)元活性標志物Fos和Npas4，研究人員在第 70 天沒(méi)有觀(guān)察到 mhCOs和hCOs的神經(jīng)元活性有任何差異；研究人員進(jìn)一步證實(shí)，在第70-80天和第110-120天，hCOs和 mhCOs都含有功能性神經(jīng)元。
接下來(lái)研究人員在小鼠大腦中檢查了PU.1誘導的小膠質(zhì)細胞在體內功能是否正常。研究人員將PU.1誘導的小膠質(zhì)細胞移植到有免疫缺陷的小鼠大腦中并進(jìn)行Aβ-oligo處理。移植3周后，人類(lèi)特異性CD68和Aβ的免疫染色顯示，PU.1衍生的小膠質(zhì)細胞表現出復雜的分枝形態(tài)并且具有功能活性，會(huì )對寡聚Aβ產(chǎn)生反應。這些數據表明，PU.1 誘導的小膠質(zhì)細胞在小鼠大腦環(huán)境中和人腦類(lèi)器官中的功能相似。
作為大腦常駐骨髓細胞，小膠質(zhì)細胞在大腦的穩態(tài)中發(fā)揮著(zhù)關(guān)鍵作用。小膠質(zhì)細胞的失調是人類(lèi)大多數腦部疾病的潛在機制，包括 AD、ASD 和精神分裂癥。然而，開(kāi)發(fā)體外模型來(lái)研究小膠質(zhì)細胞是一項重大挑戰，原發(fā)性小膠質(zhì)細胞或IPSC衍生的小膠質(zhì)細胞是目前可行的方案。但研究表明，如果不考慮與大腦中其他細胞的相互作用，研究人員就無(wú)法研究小膠質(zhì)細胞的功能和相關(guān)表型。研究小膠質(zhì)細胞中的分子結構和細胞反應需要在大腦結構的背景下產(chǎn)生小膠質(zhì)細胞研究模型。因此，研究人員開(kāi)發(fā)出的mhCOs給了解人類(lèi)小膠質(zhì)細胞在健康和疾病狀態(tài)下的功能提供了機會(huì )。
此次提出的mhCOs提供了一個(gè)方案，該方案可在腦類(lèi)器官內生成可調節數量的誘導小膠質(zhì)細胞，并通過(guò)單獨的小膠質(zhì)細胞或hCOs中的所有細胞的基因修飾來(lái)研究體外小膠質(zhì)細胞的特異性功能。研究人員可以利用這一優(yōu)勢，結合CRISPRi來(lái)確定小膠質(zhì)細胞中與 AD 相關(guān)基因在響應Aβ中的作用。與之前的研究相比，mhCOs不需要使用細胞因子和生長(cháng)因子來(lái)誘導小膠質(zhì)細胞，且mhCOs攜帶小膠質(zhì)細胞可與人腦中小膠質(zhì)細胞的位置和行為相對應。
雖然mhCOs提供了一個(gè)獨特的方案，通過(guò)該方案和基因編輯可以研究與小膠質(zhì)細胞相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，但仍然存在局限性。一是小膠質(zhì)細胞的分布在每個(gè)mhCOs內均不同。其次，并非所有在mhCOs 中過(guò)表達PU.1的細胞都分化為小膠質(zhì)細胞簇，這表明存在轉化效率低下或環(huán)境影響細胞分化的問(wèn)題。最后，mhCOs不具備內源性血管系統，因此在發(fā)育后期會(huì )產(chǎn)生不健康的細胞。內部炎癥的發(fā)生和細胞類(lèi)型復雜性的缺乏可能導致小膠質(zhì)細胞過(guò)早被激活以及過(guò)早的發(fā)育成熟。盡管如此，mhCOs開(kāi)辟了新的途徑來(lái)探索小膠質(zhì)細胞在人腦類(lèi)器官中對各種人腦疾病和大腦發(fā)育的功能。
寧波易賽騰生物科技有限公司 李福云編譯
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