2021年9月29日，Fabin Han教授領(lǐng)導的研究團隊在Frontiers in Aging Neuroscience雜志上發(fā)表了名為Current Approaches and Molecular Mechanisms for Directly Reprogramming Fibroblasts Into Neurons and Dopamine Neurons 的研究綜述，詳細闡述了當前將成纖維細胞直接轉分化獲取多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)展歷史，制備方法、內在分子機制以及轉分化神經(jīng)細胞在帕金森（PD）等神經(jīng)退行性疾病研究應用上面臨的挑戰。利用合適的生物因子組合，不經(jīng)過(guò)多能干細胞階段而直接將一種類(lèi)型的成熟體細胞轉化為另一種類(lèi)型的成熟體細胞的技術(shù)被定義為直接重編程技術(shù)，或稱(chēng)為轉分化技術(shù)。目前通過(guò)直接轉分化可以獲得多巴胺能神經(jīng)元，在PD的病理機制研究以及治療方面應用廣泛，前景良好。
研究人員發(fā)現，PD主要是由中腦的多巴胺神經(jīng)元（DA神經(jīng)元）的特異性退化引起的,主要生物標志是Lewy小體的產(chǎn)生。Lewy小體主要由退化的多巴胺神經(jīng)細胞和膠質(zhì)細胞中的蛋白聚合而成。目前市場(chǎng)上僅有一些多巴胺替代藥物，只能延緩疾病的惡化，并不能治愈患者。因此，移植細胞以取代受損的DA神經(jīng)元在治療PD病癥方面具有巨大的潛力。
早期研究人員將人類(lèi)胎兒腦源性中腦組織或fNSCs移植給PD患者，取得了一定的效果。移植的fNSCs不斷改善PD患者的癥狀，它們在一些患者的大腦中存活了16年，有的甚至達到24年以上，但使用移植細胞會(huì )產(chǎn)生倫理和免疫系統排斥等問(wèn)題。隨后研究人員開(kāi)始嘗試使用其他干細胞來(lái)治療PD，如胚胎干細胞（ESC）、間充質(zhì)干細胞（MSC）和多巴胺前體細胞，但并不能解決問(wèn)題。之后iPSCs的出現克服了免疫系統對于移植干細胞的排斥反應，在臨床方面得到廣泛應用。但iPSC誘導神經(jīng)元可能會(huì )殘留一部分未分化的細胞，并且iPSC誘導需要外來(lái)基因參與，這可能致使腫瘤產(chǎn)生，存在一定風(fēng)險。為了克服這些問(wèn)題，研究人員開(kāi)始探索從成纖維細胞直接轉分化獲得多巴胺神經(jīng)元來(lái)移植治療PD。
在通過(guò)直接轉分化制備誘導DA神經(jīng)元的過(guò)程中，研究人員發(fā)現，細胞分化方向主要是由內源性遺傳通路和表觀(guān)遺傳修飾來(lái)控制的。特定神經(jīng)元的成熟與分化，如多巴胺神經(jīng)元，涉及了一系列復雜有序的基因表達和調控。體內多巴胺能神經(jīng)元的分化過(guò)程主要有四個(gè)階段：1、胚胎干細胞在轉錄因子Ascl1、Lmx1a/b、Ngn2、En1/2、Nurr1和Pitx3等的協(xié)同作用下被誘導為神經(jīng)干細胞。2、神經(jīng)干細胞中基因進(jìn)行特異性表達，進(jìn)一步分化為多巴胺前體細胞。3、生長(cháng)發(fā)育生成早期的未成熟的多巴胺神經(jīng)元。4、轉錄因子作用于多巴胺神經(jīng)元特異性酪氨酸羥化酶（TH）和多巴胺轉運蛋白（DAT）基因的表達，促使多巴胺神經(jīng)元成熟。
圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò )
之后研究人員基于遺傳譜系示蹤技術(shù)，了解到神經(jīng)元分化過(guò)程中轉錄因子的調控網(wǎng)絡(luò )，目前已開(kāi)發(fā)出多種方法將成纖維細胞直接轉分化為DA神經(jīng)元。直接轉分化獲得神經(jīng)元主要是通過(guò)基因組DNA的表觀(guān)遺傳修飾，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、核小體定位以及抑制和刺激關(guān)鍵調節基因來(lái)實(shí)現的。目前主要方法有以下四種：1、過(guò)表達轉錄因子。2、基于RNA的轉錄因子調節。3、轉錄因子與小分子化合物或其他物理因素結合共同作用。4、基于蛋白質(zhì)的表觀(guān)遺傳修飾誘導。小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）和人源成纖維細胞是當前研究人員最常用的啟動(dòng)細胞。
2006年，研究人員首 次通過(guò)逆轉錄病毒介質(zhì)過(guò)表達四個(gè)轉錄因子，即Oct3/4, Sox2, Klf4, and c-Myc，將小鼠的皮膚成纖維細胞轉分化為誘導DA神經(jīng)元。2007年，Yamanaka和Thomson實(shí)驗室的研究報告表明，通過(guò)逆轉錄病毒轉染OCT3/4, SOX2, KLF4, and c-MYC or lentiviral- mediated介質(zhì)過(guò)表達OCT4, SOX2, NANOG,LIN28四個(gè)轉錄因子成功將人類(lèi)成纖維細胞轉分化為誘導DA神經(jīng)元。研究人員報告稱(chēng)，由于成人大腦是由神經(jīng)前體細胞或神經(jīng)干細胞分化而來(lái)的各種神經(jīng)元組成，內部環(huán)境十分復雜，現有的模型并不能模擬出體內的神經(jīng)元狀態(tài)，模型匹配性較差，研究結果十分不理想。
圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò )
另外，在直接轉分化的分子作用機制上，作者總結了轉錄因子的作用、轉錄組的調節網(wǎng)絡(luò )以及細胞過(guò)渡不同階段的表觀(guān)遺傳修飾。目前可以通過(guò)過(guò)表達特定的轉錄因子、miRNA或者與化合物組合調節Wnt, Notch,和 JAK/STAT信號通路刺激或抑制遺傳表觀(guān)基因的表達來(lái)獲取誘導多巴胺神經(jīng)元?？紤]到外源轉錄因子基因可能會(huì )整合到宿主細胞的基因組中，誘導基因突變，研究人員表示以后的直接轉分化可以利用episomal質(zhì)粒取代病毒載體來(lái)表達特異性轉錄因子，無(wú)需經(jīng)過(guò)轉基因整合。此外，使用RNA、miRNA、蛋白質(zhì)或者小分子化合物來(lái)實(shí)現直接轉分化獲取多巴胺神經(jīng)元也是一種安全方法。
雖然直接轉分化不需要經(jīng)過(guò)多能干細胞狀態(tài)，不會(huì )有腫瘤形成的風(fēng)險，在神經(jīng)退行性疾病的藥物篩選和移植治療方面具有巨大潛力，但就目前而言，直接轉分化效率低下，移植后細胞存活率低，在實(shí)際研究應用中仍具有一定困難。對此，作者表示，隨著(zhù)對分子機制和信號通路的更加深入的了解，未來(lái)將會(huì )開(kāi)發(fā)出更高效的直接轉分化方法和細胞分離純化技術(shù)，以制備大量的誘導神經(jīng)元和多巴胺神經(jīng)元，這些神經(jīng)元更接近其自然狀態(tài)，為臨床治療PD和其他神經(jīng)退行性疾病研究提供充足的神經(jīng)細胞模型。
寧波易賽騰生物科技有限公司 李福云編譯
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https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8515543/
